نوع مقاله: مقاله کامل پژوهشی

نویسندگان

1 دانش آموختة کارشناسی ارشد، بیوتکنولوژی در کشاورزی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه زنجان

2 استادیار، گروه زراعت و اصلاح نباتات، دانشکده کشاورزی، دانشگاه زنجان

3 استادیار، گروه زیست شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه زنجان

چکیده

امروزه مشکلاتی که جذب ساکارز برای سلامتی افراد به‌وجودآورده، تقاضا برای شیرین‌کننده‌های طبیعی دارای مزۀ مطلوب‌تر و جذب کمتر ازجمله پروتئین‌های شیرین را افزایش داده است. در میان آنها برازئین به واسطۀ شیرینی قوی، منشاء طبیعی و پایداری مطلوب جایگزینی مناسب برای ساکارز محسوب می‌شود. برازئین از میوة گیاه آفریقایی Pentadiplandra brazzeana Baillon که تولید تجاری آن در مقیاس بالا غیرعملی است، جدا شده است. بنابراین تولید تجاری وسیع این پروتئین نیازمند بیان آن در یک سیستم هترولوگوس ازطریق تکنولوژی DNA نوترکیب است. در این پژوهش باتوجه‌به در دسترس نبودن ژنوم گیاه P. brazzeana سنتز مصنوعی ژن برازئین با استفاده از تکنیک‌های Assembly PCR و SOEing PCR انجام شد. ابتدا توالی اسیدآمینه‌ای پروتئین برازئین با سرور Emboss Backtranseq براساس کدون‌های ترجیحی ذرت به توالی 162 نوکلئوتیدی ترجمه شد. سپس با استفاده از 6 آغازگر هم‌پوشان طی 5 واکنش متوالی PCR توالی کامل ژن برازئین سنتز شد. نتایج حاصل از واکنش PCR صحت کار را نشان داد. سپس قطعۀ حاصله در وکتورهای بیانی گیاهی pBI121 با پیشبر عمومی CaMV35S و پیشبر اختصاصی بذر Napin کلون شد و نتایج تعیین توالی صحت قطعۀ سنتزی کلون‌شده را تأیید کرد.

کلیدواژه‌ها

Assadi-Porter, F.M., Aceti, D.J, & Markley, J.L. 2007. Efficient and rapid protein expression and purification of small high disulfide containing sweet protein brazzein in E. coli. Protein Expression and Purification, 58(2):259-365.

Berlec, A., Jevnikar, Z., Majhenič, A., Rogelj, I., & Štrukelj, B. 2006. Expression of the sweet-tasting plant protein brazzein in Escherichia coli and Lactococcus lactis: a path toward sweet lactic acid bacteria. Applied Microbiology and Biotechnology, 73(1):158-165.

Bo, C. 2007. Synthesize the plant sweet protein brazzein gene with overlapping PCR. Journal of Biotechnology, 17(4):43-45.

Faus, I. 2000. Recent developments in the characterization and biotechnological production of sweet-tasting proteins. Applied Microbiology and Biotechnology, 53(2):145-151.

Gustafsson, C., Govindarajan, S., & Minshull, J. 2004. Codon bias and heterologous protein expression. TRENDS in Biotechnology, 22(7):346-353.

Hood, E.E., Bailey, M.R., Beifuss, K., Magallanes-Lundback, M., Horn, M.E., Callaway, E., Drees, C., Delaney, D.E., Clough, R., & Howard, J.A. 2003. Criteria for high-level expression of a fungal laccase gene in transgenic maize. Plant Biotechnology Journal, 1(2):129-140.

Horton, R.M., Hunt, H.D., Ho, S.N., Pullen, J.K., & Pease, L.R. 1989. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene, 77(1):61-68.

Jin, Z., Danilova, V., Assadi-Porter, F.M., Aceti, D.J., Markley, J.L. & Hellekant, G. 2003. Critical regions for the sweetness of Brazzein. FEBS letters, 544:33-37.

Jo, H.J., Noh, J.S., & Kong, K.H. 2013. Efficient secretory expression of the sweet-tasting protein brazzein in the yeast Kluyveromyces lactis. Protein Expression and Purification, 90(2):84-89.

Kim, C.H., Oh, Y., & Lee, T.H. 1997. Codon optimization for high-level expression of human erythropoietin (EPO) in mammalian cell. Gene, 199:293-301.

Lamphear, B.J., Barker, D.K., Brooks, C.A., Delaney, D.E., Lane, J.R., Beifuss, K., & Howard, J.A. 2005. Expression of the sweet protein brazzein in maize for production of a new commercial sweetener. Plant Biotechnology Journal, 3(1):103-114.

Lau, O.S., and Sun, S.S. 2009. Plant seeds as bioreactors for recombinant protein production. Biotechnology advances, 27(6):1015-1022.

Li, G., Guo, A., & Fan, S .2003. Cloning and expressing of brazzein gene. Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica, 24(7):1271-1274.

Li, G., Dong, B.X., Liu, Y.H., Li, C.J., & Zhang, L.P. 2013. Gene synthesis method based on overlap extension PCR and DNAWorks Program. P. 9-17. In K.M. Polizzi & C. Kontoravdi (eds.) Synthetic Biology. Chapter 2. Humana Press.

Mansouri, F., Modarressi, M.H., Abolhassani, M., & Parivar. K. 2011. Synthesis and production of Sweet-tasting protein in E. coli and purification by amylose resin. Journal of Sciences, Islamic Republic of Iran, 22:105-110.

Ming, D., & Hellekant, G. 1994. Brazzein, a new high-potency thermostable sweet protein from Pentadiplandra brazzeana B. FEBS letters, 355(1):106-108.

Peeters, K., De-Wilde, C., & Depicker, A. 2001. Highly efficient targeting and accumulation of a Fab fragment within the secretory pathway and apoplast of Arabidopsis thaliana. FEBS Journal, 268(15):4251-4260.

Sambrook, P. Maccallum, D. Russel. 2001. Molecular cloning: A laboratory manual third ed., Cold Springs Harbour Press, New York, 2001. p. 2344.

Stoger, E., Ma, J.K., Fischer, R., & Christou, P. 2005. Sowing the seeds of success: pharmaceutical proteins from plants. Current Opinion in Biotechnology, 16(2):167-173.

Swarnalatha, I., Dinesh kumar, V., Ansari, N.A, & Sivasankar, A. 2010. Studies on the expression pattern of seed-specific napin promoter (BcNAI) in transgenic ( Nicotiana tabacum L.) tobacco seeds. International Journal of Environmental Science and Development, 1(1):20-23.

Temussi, P. 2006. The history of sweet taste: not exactly a piece of cake. Journal of Molecular Recognition, 19(3):188-199.

Twyman, R.M., Stoger, E., Schillberg, S., Christou, P., & Fischer, R. 2003. Molecular farming in plants: host systems and expression technology. TRENDS in Biotechnology, 21(12):570-578.

Xiong, A.S., Yao, Q.H., Peng, R.H., Zhang, Z., Xu, F., Liu, J.G., & Chen, J.M. 2006. High level expression of a synthetic gene encoding Peniophora lycii phytase in methylotrophic yeast Pichia pastoris. Applied Microbiology and Biotechnology, 72(5):1039-1047.

Zhao, G.Q., Zhang, Y., Hoon. M.A., Chandrashekar, J., Erlenbach, I., Ryba. N.J., & Zuker, C.S. 2003. The receptors for mammalian sweet and umami taste. Cell, 115(3):255-266.

Zhang, P., Ding, Y., Liao, W., Chen, Q., Lee, H., Qi, P., & Pan, W. 2013. A simple, universal, efficient PCR-based gene synthesis method: Sequential OE-PCR gene synthesis. Gene, 524(2):347-354.